细胞解冻和培养指南

冻存的ATCC细胞株和杂交瘤细胞株在运送过程中使用干冰保持低温。收到冻存细胞后，可以立即解冻复苏，去除二甲基亚砜（DMSO）后进行细胞培养。如果不立即复苏培养细胞，必须将细胞冻存管放置于液氮罐气相层存储。请不要将细胞存储在-130℃以上的温度。如果温度不够低，达不到-130℃，细胞活力会迅速下降。

操作推荐

ATCC推荐在操作冻存的ATCC细胞株时使用手套，工作服和防护面具以避免任何事故发生。

检查包装，查看是否有任何破裂或渗漏。冻存的ATCC细胞株应处于固体状。

将冻存的ATCC细胞株从有干冰的包装中取出，立即复苏培养，或迅速转移放置在液氮罐气相层在-130℃以下的温度存储。

冻存细胞的复苏和培养

1、先准备好细胞培养皿或细胞培养瓶，及产品说明推荐的相应细胞培养基。并在37℃水浴中预先温热细胞培养基。（请参阅：注1）

2、小心取出装有细胞的冻存管，保持管盖拧紧，将冻存管盖以下的部分置于37℃水浴中并轻微的搅拌以帮助解冻。解冻过程应该尽快，大约短于2分钟或待后一块小冰晶体刚融化，就应将细胞冻存管取出水浴。

3、在水浴中取出的细胞冻存管表面喷洒70%乙醇配制的消毒剂，用无菌纸巾或纱布拭干。之后的操作步骤都应该遵循在无菌条件下生物安全柜中严格操作。

4、小心拧开冻存管的顶部，将管内容物用1ml移液枪转移到含9毫升培养基的无菌离心管中。离心5到7分钟（125xg），小心吸去上清液以去除抗冻剂（二甲基亚砜），避免丢失细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于配好的*培养基中。将细胞悬液转移到培养容器，轻轻摇晃使细胞均匀的分布。生长较慢的细胞株可重悬于5-8ml培养基并转移到T25培养瓶。生长较快的细胞株可重悬于12-20ml培养基并转移到T75培养瓶。

5、将细胞培养容器置于细胞培养箱，在温度37℃，二氧化碳浓度5%的培养条件下进行孵育。细胞培养24小时后应在显微镜下观察细胞形态和生长状况。（请参阅：注2）

*注1：虽然大多数细胞株可以在一种以上的培养基中生长，但细胞的特征有可能会在更换不同培养基时发生。为保证好的效果，请从细胞培养一开始就使用ATCC推荐的培养基。

*注2：某些细胞株，如杂交瘤株，可能需要几天的时间才从冻存状态下*恢复正常生长。在细胞复苏培养天可能会呈现较低的细胞活力并产生一些细胞碎片。度过这一时期后，细胞会恢复并进入指数增长期。

武汉中昌国研标物科技有限公司提示您：

细胞株的生长有两种状态，贴壁细胞需要附着在一个表面进行生长（贴壁依赖性），悬浮细胞可在悬浮培养状态下生长（非贴壁依赖）。在细胞单层贴壁生长货悬浮生长中，都通常遵循四个特征性阶段：迟滞期、对数或指数期、静止或平台期及衰退期。